第一章       非特异性免疫实验

 

前言

非特异性免疫,又称固有性免疫,是生物体在长期进化中,在与危害机体的病原微生物或其他异物的相互斗争中建立起来的一种天然防护能力,它是体内一切免疫防护力的发展基础。非特异性免疫功能生来就有,可以遗传给后代,作用迅速而对各种病原体或异物无选择性,并且没有免疫记忆。执行非特异性免疫功能的主要有体表屏障(包括皮肤、粘膜以及它们的分泌物,如皮脂腺分泌的不饱和脂肪酸,唾液腺分泌的溶菌酶等),各种体内屏障(如血脑屏障、血胎屏障、血睾屏障等),细胞因素(中性粒细胞、单核-巨噬细胞、NK细胞等)以及体液因素(补体、溶菌酶、C反应蛋白等)。本章将介绍一些检测非特异性免疫功能的常用试验。

 

第一节       溶菌酶测定

实验一  唾液溶菌酶测定

[原理]

溶菌酶(lysozyme,LZM)是一种分子量为14.7KD不耐热的碱性蛋白质,主要来源于吞噬细胞,广泛分布于各种外分泌液及吞噬细胞溶酶体中。溶菌酶能水解细菌细胞壁成分肽聚糖骨架中N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4糖苷键,主要引起革兰阳性菌裂解。在混有一定浓度菌液的琼脂平皿中打孔,孔中加入待检唾液标本,如果标本中含有溶菌酶,则孔周围的细菌被裂解,该区域琼脂的透光度增强,即形成透明的溶菌圈。在一定范围内,圈的大小与溶菌酶的含量成正比,如果事先用不同浓度的溶菌酶标准品制成标准曲线,则可以根据溶菌圈的大小求得待测标本溶菌酶的含量。

[器材与试剂]

1.溶壁微球菌菌液、麦氏比浊管。

2.琼脂、pH6.4的磷酸盐缓冲溶液PBS、无菌平皿。

3.正常人唾液、溶菌酶。

4.打孔器、牙签、毛细吸管、毫米尺等。

[方法]

1.菌液的准备:将溶壁微球菌于普通琼脂斜面上传代一次,再接种于普通琼脂斜面上,置37培养24小时。用PBS将菌苔洗下,用麦氏比浊管比浊,将菌液浓度调整至2×1012/ml

2.琼脂平皿的制备:称取1g优质琼脂,加入到100ml PBS中,加热融化,冷却至6070℃时,加入1ml菌液,摇匀后倾注于无菌平皿中(直径78cm,加入约15ml),平放待凝。

3.打孔:用打孔器按图1打孔,孔内残留的琼脂可用牙签挑出,并于平皿底做好标记。

4.唾液的采取:先用清水漱口,等13分钟,将唾液吐于空平皿中待用。

5.加样:分别用毛细吸管将PBS、唾液标本和溶菌酶加入已标记的孔内,至室温培养1518小时。

[结果]

1号孔有溶菌圈(阳性对照);,4号孔无溶菌圈(阴性对照);注意23号孔周围是否出现溶菌圈,如果有溶菌圈,测量其直径,再与1号孔比较并作记录。

1号孔:溶菌酶; 2号孔:人唾液标本1 3号孔:人唾液标本2 4号孔:PBS

孔径6mm  孔距20mm

1唾液溶菌酶测定

 

[注意事项]

1.    制作琼脂平皿时加入菌液的时间要合适,过早会导致细菌自发裂解,过晚则难以混匀。

2.    向琼脂孔中加样时,以样品注满小孔为宜,不应溢出。如果有溢出可以用滤纸吸干。

 

 

第二节       补体测定技术

实验二  CH50法血清总补体活性测定

[原理]

CH5050 Complement Haemolytic activity法,是一种相对定量的测量血清总补体活性的方法。补体能使经溶血素(抗绵羊红细胞抗体)致敏的绵羊红细胞发生溶血,且溶血程度与补体含量和活性呈正相关,但并非直线关系。以补体量为横坐标,红细胞的溶血程度为纵坐标,可得到一条清晰的“S”型曲线。当溶血程度接近100%时,补体量的变化对溶血的程度影响不大,而在3070%之间,只要补体量稍有变化,就可对溶血程度产生很大影响,所以,用50%溶血作为判定终点要比100%更为敏感。

将新鲜待检血清做不同稀释后,与一定量致敏红细胞反应,测定溶血程度,以50%溶血时的血清量判定终点,可测知补体总溶血活性。

2溶血程度与补体含量的关系

 

[器材与试剂]

1.缓冲盐水(pH7.4):取NaCl 75g1mol/L HCl 177ml,三乙醇胺28mlMgCl2·6H2O 1.0gCaCl2·2H2O  0.2g。先将NaCl 溶于700 ml蒸馏水中,再加入HCl和三乙醇胺。将MgCl2·6H2OCaCl2·2H2O分别2 ml蒸馏水溶解后,逐一加入,再用蒸馏水加至1000 ml4℃保存。临用前取上述溶液1份加9份蒸馏水,4℃保存待用。

2.2%SRBC悬液:新鲜脱纤维羊血或Alsever液保存羊血(4℃可保存3周)用生理盐水洗2次,第三次用缓冲盐水,2000rpm离心30min。取压积红细胞以缓冲盐水配成2%悬液。为使浓度标准化,可将2%SRBC悬液用缓冲盐水稀释25倍,于分光光度计(542nm)测定透光率(以缓冲盐水校正透光率至100%)。每次实验用红细胞浓度(透光率)必须一致。

3.溶血素(anti-SRBC):有商品出售,按说明书所标效价以缓冲盐水稀释至2单位。如效价为18000,则使用时稀释至14000

4.致敏SRBC2%SRBC加等量2单位溶血素,混匀,置37℃水浴10min

5.50%溶血标准管:取2%SRBC悬液0.5ml,加入蒸馏水4.5ml,混匀。

6.生理盐水、37℃水浴箱离心机、分光光度计、试管、吸管等。

[方法]

1.      取待检人血清0.2ml,加入缓冲盐水3.8ml,使成120稀释。

2.      按下表所示加入各试剂,混匀,将试管置于37水浴30min

 

  CH50法测定总补体活性操作

试管编号

1:20稀释血清(ml

缓冲盐水(ml

致敏SRBCml

CH50U/ml

1

0.10

1.40

1.0

200

2

0.15

1.34

1.0

133

3

0.20

1.30

1.0

100

4

0.25

1.25

1.0

80

5

0.30

1.20

1.0

66.6

6

0.35

1.15

1.0

57.1

7

0.40

1.10

1.0

50

8

0.45

1.05

1.0

44.4

9

0.50

1.00

1.0

40

10

1.50

1.0

 

3.      将各试管2500rpm离心5min,取上清液与50%溶血标准管目视比较,观察溶血程度。取与50%溶血标准管相接近的两管在分光光度计上分别读取光密度值A542nm 0.5cm比色杯,以缓冲盐水作为空白调零),以最接近50%溶血标准管的一管,按下列公式计算CH50活性。

 

                            1

   CH50U/ml=                              X 20(稀释倍数)

                  引起50%溶血管的血清量(ml

正常参考值:50100 U/ml

 

[注意事项]

1.      本法简便快速,但敏感性较低,不能测定补体蛋白的绝对值。

2.      总补体活性的测定主要反映补体C1~C9通过经典途径活化的程度。

3.      待检血清标本应无溶血、无乳糜、无污染。

4.      缓冲液、致敏SRBC均应新鲜配制,缓冲液若被细菌污染,会导致自发溶血。

5.      待检血清标本必须新鲜,如室温放置2h以上,会使补体活性下降。

6.      实验所用玻璃器皿,一定要清洁,酸碱均能影响测定的准确性。

7.      测定需在0-4进行,试管需预冷,可保持补体活性。

8.      补体的溶血活性与反应时缓冲液的pH、离子强度、钙镁离子量、羊红细胞量、反应总体积及反应温度均有一定关系,因此实验时需对反应的各个环节做严格控制。

[意义]

补体含量或活性异常主要见于:

1.    补体总量升高

恶性肿瘤、某些传染病、炎症、梗阻性黄疸、急性心梗、溃疡性结肠炎、糖尿病、痛风、甲状腺炎、急性风湿热、皮肌炎、结节性动脉周围炎

2.    补体总量降低

    消耗过多:肾炎、SLE、自身免疫性溶血性贫血、类风湿性关节炎、移植排斥反应、肾病综合症、大面积烧伤、外伤、手术、失血。

    合成不足:肝病患者。

    遗传性补体缺陷

 

实验三  补体旁路活化途径的溶血活性(AP-H50)测定

[原理]

EGTA(乙二醇双醚四乙酸)螯合待检血清中Ca2+的,封闭C1作用,阻断补体经典活化途径。加入可使B因子活化的兔红细胞RE,导致补体旁路途径激活,RE被损伤而发生溶血。溶血率与补体旁路途径的溶血活性之间的关系类似于CH50,故也以50%溶血为终点。

[器材与试剂]

1.    1mol/L EGTANaOH 3.5g溶于85ml蒸馏水中,加入EGTA19g,使溶解,补足蒸馏水至500ml

2.    巴比妥缓冲液:NaCl 21.25g,巴比妥1.44g,巴比妥钠0.94g,加蒸馏水至500ml

3.    稀释液:0.1mol/L EGTA 80ml,巴比妥缓冲液180mlMgCl2·6H2O  0.41g,加蒸馏水补足至1000ml。以1mol/L NaOH 调节pH7.5

4.    0.5%RE:用Alsever氏液保存于4,可用2周。用前以生理盐水洗2次,稀释液洗1次(2000rpm,离心10min)。取压积红细胞用巴比妥缓冲液配制0.5%RE悬液。

5.    50%溶血标准管:取0.5%RE 0.2ml,加蒸馏水0.8ml,混匀。

6.    37℃水浴箱、分光光度计、试管、吸管等。

[方法]

1.    取待检血清0.3ml加稀释液0.9ml,使成14稀释,37水浴10 min

2.    按下表所示加入各反应液,充分混匀,将试管置37水浴30 min

 

AP-H50 测定操作表

试管编号

14待检血清(ml

稀释液(ml

0.5%REmL

1

0.10

0.50

0.40

2

0.15

0.45

0.40

3

0.20

0.40

0.40

4

0.25

0.35

0.40

5

0.30

0.30

0.40

 

3.    将各试管离心5,取上清夜与50%溶血标准管目视比较,观察溶血程度。取与50%溶血标准管相接近的两管在分光光度计上分别读取光密度值A542nm 0.5cm比色杯,以稀释液作为空白调零),以最接近50%溶血标准管的一管,按下列公式计算AP-H50活性,AP-H50正常值范围为21.7 ±5.4 U/ml

[结果]

                                 1

    AP-H50U/ml=                             X 20(稀释倍数)

                    引起50%溶血管的血清量(ml

[注意事项]

1.      兔红细胞可能存在个体差异,更换采血时应预试。

2.    本法测定的是补体旁路途径活化的溶血活性,参与的成分为补体C3C5-C9P因子、D因子、B因子等,其中任何成分的异常旁路途径溶血活性的改变。

[意义]

 

 

 

 

第三节       吞噬细胞功能测定

体内具有吞噬功能的细胞群按其形态的大小分两类,一类为大吞噬细胞,另一类为小吞噬细胞,亦即中性粒细胞,两类细胞在形态上各有其特征。外周血或实验动物腹腔液等标本中白细胞分类和计数为重要的常规指标,人外周血中性粒细胞的数量对诊断大多数感染性疾病具有重要的参考价值。吞噬细胞的吞噬活动大致分趋化、吞噬和胞内杀灭作用三阶段,在免疫学实验研究和临床检验中已建立相应的检测方法。

 

 

实验四  中性粒细胞吞噬功能测定

[原理]

将中性粒细胞与可被吞噬而又易于计数的颗粒物质(如金黄色葡萄球菌)混合孵育一定时间后,颗粒物质被中性粒细胞吞噬。根据吞噬率和吞噬指数可以反映该细胞的吞噬功能。

[器材与试剂]

1.20FCS-RPMI1640培养液,0.015mol/L PBS(pH6.4)

2.金黄色葡萄球菌培养物、Wright-Giemsa染液75酒精、肝素。

3.吸管、试管、一次性采血针、微量细胞培养板、CO2培养箱、显微镜等。

[方法]

1.      灭活金黄色葡萄球菌悬液配制:取金黄色葡萄球菌24小时琼脂斜面培养物,用无菌生理盐水洗下菌苔,以PBS洗涤两次,100灭活15分钟。取灭活后的金黄色葡萄球菌混悬于20FCS-RPMI1640培养液中,用血细胞计数板计数,调整浓度至6×107/ml

2.      无菌采手指血2滴(约100μl,肝素抗凝)加入微量细胞培养板孔内。

3.    向孔内加入6×107/ml灭活金黄色葡萄球菌悬液2滴,混匀。

4.    37 5CO2培养箱内培养30分钟。

5.    取一滴培养后的混合液滴片,冷风吹干,用Wright-Giemsa染液染10分钟,加PBS浸洗56分钟,吹干,油镜下观察。

[结果]

计数200个中性粒细胞,分别记下吞噬了细菌的细胞数和各个吞噬细胞吞入的细菌数,按下面的公式分别求其吞噬率和吞噬指数。正常人参考值:中性粒细胞吞噬率994%,中性粒细胞吞噬指数2030

               吞噬了细菌的中性粒细胞数

    吞噬率                            ×100

               200(计数的中性粒细胞总数)

 

               中性粒细胞吞噬的细菌总数

    吞噬指数=                           ×100

               200(计数的中性粒细胞总数)

 

[注意事项]

1.    取金黄色葡萄球菌菌苔时位置要准确,尽量避免杂质。

2.    如果没有CO2培养箱,置37℃水浴箱也可以。

[意义]

中性粒细胞吞噬及杀灭病原体是一个复杂的过程,包括趋化、吞噬和胞内代谢数个阶段,其中任一环节发生障碍或缺陷时,均可导致中性粒细胞吞噬功能下降或缺如。现已知多种免疫缺陷病(如Chediak-Higashi综合征、Wiskott-Aldrich综合征等),某些慢性病(如糖尿病)以及烧伤患者和正常新生儿中性粒细胞的趋化能力明显低下;补体或抗体缺陷时其吞噬能力低下;而慢性肉芽肿及G-6-PD缺陷时其杀伤功能低下。

 

 

实验五  巨噬细胞吞噬功能测定

[原理]

巨噬细胞是一种多功能的细胞,它具有吞噬消化功能,能分泌多种物质,如水解酶等组织损伤物质,补体、干扰素、溶菌酶等与防御有关的物质,以及具有免疫调节功能的物质,如IL-1PGE2等。巨噬细胞还能通过吞噬、处理和提呈抗原,激活淋巴细胞或启动和加强淋巴细胞的免疫活性,参与细胞免疫和体液免疫的传入支。人的巨噬细胞可经斑蝥激发的皮泡液中获取,也可从肺灌洗液或患者腹膜透析液中分离,但操作繁琐,得量不多。许多实验室在进行基础或配合临床研究巨噬细胞功能及其与疾病的关系、或筛检免疫增强药物和探讨其作用机制时,常选用小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象。

目前检测巨噬细胞功能的常用方法是巨噬细胞吞噬功能的测定。

[器材与试剂]

1.    昆明种小白鼠(59周龄,体重1832克)。

2.    75%酒精,Hank’s(pH7.2),白色念珠菌悬液(浓度为3×107/ml,1%甲紫染液。

3.    离心机,恒温水浴箱,显微镜。

4.    有齿镊,一次性注射器,手术剪,毛细吸管,试管,血球计数板等。

[方法]

1.    提取小鼠腹腔巨噬细胞:颈椎脱臼法处死小鼠,腹部皮肤以75%酒精消毒,用有齿镊拉开腹部皮肤暴露腹壁,提起腹壁用注射器把2ml Hank’s液注入腹腔,轻轻揉按腹壁约5分钟,用手术剪将腹壁剪一小孔,用毛细吸管收集腹腔中的液体(尽量多收集),放试管内。

2.    将巨噬细胞与白色念珠菌混合:装有腹腔液的试管离心后(100g×10分钟)弃去上清,留0.51ml,加入白色念珠菌悬液两滴,混匀,置3730分钟(每隔10分钟摇匀一次)。

3.    染色、结果观察:水浴后再将试管离心(200g×5分钟),弃上清,仅留02.0.5ml,加入1%甲紫染液两滴,混匀,5分钟后滴片,镜下观察。

[结果]

结果的判断与中性粒细胞吞噬功能测定实验相同:镜下计数200个巨噬细胞,包括未吞噬白色念珠菌的巨噬细胞数目,吞噬了白色念珠菌的巨噬细胞数目以及所吞噬白色念珠菌的数目,按实验五的公式计算巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数。正常人参考值:巨噬细胞吞噬率62.8±1.4%,吞噬指数1.06±0.05%。

[注意事项]

1.    吸取小鼠腹腔液时应尽量避免混入血液,否则混入的红细胞将影响巨噬细胞的吞噬以及结果的观察。

2.    加入染色液后混匀要有一定的力度,否则细胞成团,影响计数。

[意义]

巨噬细胞吞噬功能低下见于某些免疫缺陷症以及多种肿瘤病人(如胃癌、肠癌等),所以巨噬细胞吞噬功能可以作为判断机体抗肿瘤能力的指标之一。对肿瘤患者作定期检测可以考核治疗效果以及作为判定肿瘤复发、转移的简易指标。